기술&시장동향

전문가기고 [이정민, 정인영] 유전자 편집 기술을 통한 차세대 CAR-T 세포 치료제 개발

2018-05-291,040

유전자 편집 기술을 통한 차세대 CAR-T 세포 치료제 개발

( 이정민 – 연구소장, 정인영 – ㈜툴젠 치료제 연구소, 선임연구원)

최근 각광 받고 있는 키메라 항원 수용체 T 세포 (CAR-T)는 B세포암을 비롯한 여러 혈액암에 대해 매우 높은 치료 효과를 보여주고 있다. 하지만 복잡한 제조 공정, CAR 표적 항원의 결핍, 고형암에 대한 낮은 유효성등은 해결해야 할 미 충족 의료 수요 (unmet medical need) 이다. 최근 이러한 한계를 극복하기 위해 Zinc Finger Nuclease (ZFN), Transcription Activator-Like Effector Nucleases (TALEN), CRISPR/Cas9와 같은 유전자 편집 기술이 적극적으로 활용되고 있으며, 본 리뷰에서는 현재 CAR-T 치료법에서의 미 충족 의료 수요를 진단하고, 유전자 편집기술을 통해 이러한 수요를 해결할 수 있는 방안에 대해 논의 하고자 한다.

1. Introduction (from 1st generation CAR to next-generation CAR)

1세대 CAR은 CD3ζ의 ITAM 보유 도메인을 신호전달 도메인으로 포함하고 CD28, CD137, CD278과 같은 costimulatory 도메인은 포함하지 않았기 때문에 항암 효능이 충분히 발현되는데 한계가 있었다 (Ma et al., 2002; Park et al., 2007). 후속연구를 통해 1세대 CAR의 신호전달 도메인에 costimulatory 도메인을 추가한 2세대 CAR가 개발되었으며, 개발된 2세대 CAR-T는 1세대 CAR-T에 비해 CAR 의 발현 지속성과 항종양 기능이 크게 개선되어 B 세포암에서 매우 높은 치료 효과를 보여 주었다 (Moeller et al., 2004; Savoldo et al., 2011). B-ALL에서 70-94 %, CLL에서 40-75 %, CLL에서 57-68 %의 완전 관해율이 보고되었으며, 이러한 결과를 바탕으로 2017년 노바티스의 Kymriah와 카이트파마의 YESCARTA가 미국 FDA로부터 승인을 받게 되었다 (Park et al., 2016).

하지만 이러한 임상 효능에도 불구하고, CAR-T 치료제에 대한 안전성 문제가 꾸준히 제기되고 있는 상황이다. 현재까지 진행된 CD19 CAR-T 임상시험에서 관찰된 가장 보편적인 독성반응은 발열, 불쾌감, 저혈압 및 모세 혈관 누출 증후군 등을 야기하는 cytokine release syndrome (Lee et al., 2015; Porter et al., 2015) 과 BBB 투과성 증가 및 내피 세포 활성화에 의해 유도되는 신경독성 반응이며 (Gust et al., 2017), CD19 CAR-T 치료를 받은 환자의 경우, 정상 B세포의 결핍으로 인한 감염을 예방하기 위해 평생 동안 intravenous immunoglobulin 을 투여받아야 하는 부작용이 문제로 남아 있다 (Kochenderfer et al., 2012).

이러한 문제들을 해결하기 위해 합성생물학적 엔지니어링 기법을 이용하여 종래의 CAR보다 안전성과 제어성이 증대된 차세대 CAR가 개발되고 있다. FK506 또는 라파마이신 결합 단백질을 CAR 구조에 결합시킴으로써, 특정 small molecule을 통해 CAR 활성을 조절하려는 시도가 보고되었으며 (Wu et al., 2015) 보스턴 대학 연구진에 의해 개발된 leucin zipper 도메인을 포함한 SUPRA CAR는 zipFv의 친화력 및 투여량을 조절하여 T 세포 활성을 정밀하게 컨트롤 할 수 있는 결과를 보여주었다 (Cho et al.,). 가장 대표적인 차세대 CAR 개발사례는 SynNotch CAR 플랫폼으로, 종양 근처에서 CAR 발현을 제한적으로 조절할 수 있어 기존 CAR-T 세포의 off-the-target 독성을 획기적으로 감소시킬 수 있는 가능성을 보여주었다 (Roybal et al., 2016). 최근 길리어드가 SynNotch 플랫폼을 보유한 Cell Design Labs을 $567M에 인수한 사례에서 알 수 있듯, 합성생물학 기반의 차세대 CAR 개발은 학계 뿐만 아니라 산업계에서도 많은 관심을 받고 있다.

2. Medical unmet need in CAR-T

앞서 기술한 혈액암에 대한 2세대 CAR-T의 높은 항암 효능과, 차세대 CAR-T 개발을 통한 안전성 개선 노력에도 불구하고, 다음과 같은 CAR-T 치료제의 미 충족 의료 수요는 임상 적용을 위해 해결되어야 할 부분으로 남아있다. 첫째, 현재 개발된 CAR-T 치료제는 모두 자가유래 맞춤 치료제로 생산공정이 복잡하여 품질관리가 어렵고, 적시에 환자에게 치료제를 공급하는 것이 쉽지 않다. 둘째, 특정 항원이 CAR-T 세포의 자살을 유도할 경우 표적 항원의 선택에 제한이 있으며, 이는 CAR-T 개발의 심각한 저해요인이 되고 있다. 마지막으로, 기존 CAR-T는 T-cell exhaustion 및 종양미세환경 (TME)의 다양한 면역억제성 메커니즘에 취약하여 고형암에서 항암 효과가 떨어지는 한계가 있다.

A. Challenges in manufacturing process of autologous CAR-T

자가유래 CAR-T 치료제는 대량생산이 불가능하고 환자맞춤형으로만 생산되며, 생산공정의 출발물질인 각 환자로부터 채취한 T세포의 면역활성이 상이하여 균질한 품질의 CAR-T를 생산하는 것이 쉽지 않다 (Singh et al., 2016). 또한 자가유래 CAR-T의 제조공정은 T세포 채취현장과 제조현장 그리고 치료현장 간의 유기적인 협력과 고도로 통제된 품질관리가 필수적인데 이것을 위한 컨트롤이 매우 복잡하다 (Levine et al., 2017). 기존 자가유래 CAR-T는 위에서 기술한 복잡한 제조특성으로 인해 다른 치료제 대비 가격이 상당히 높아, 현재 승인된 CD19 CAR-T 치료제의 경우 1회 투여비용이 $350,000- $500,000이며, 여기에 부작용 및 투여 후 사후 관리 비용까지 계산하면 시장에서 확대되기 어려운 측면이 있다. 마지막으로, 자가 CAR-T는 생산에 약 3-4주가 소요되기 때문에 암의 진행속도가 빠른 환자는 CAR-T 치료제를 투여하기 전에 사망할 수 있는 치명적 단점이 있다.

B. Limited CAR target antigen

CAR 타겟항원은 CAR-T 치료의 임상결과를 결정 짓는 가장 중요한 요소 중 하나이다. 좋은 표적 항원은 다음의 두 가지 조건을 충족해야 하는데, 첫째 모든 종양 세포에 편재적으로 발현되어야 하며 둘째 CAR-T 세포의 표적 독성을 최소화하기 위해 표적 항원이 종양세포에만 국한 되어 발현되어야 한다. 하지만 종양세포에 편재되어 발현되는 항원 중, 정상 T세포 표면에서도 발현되는 항원의 경우 CAR를 T세포에서 발현시키면 정상 T세포끼리 서로 공격하여 CAR-T세포의 자살을 유도할 수 있으며, 이런 CAR-T의 자살효과는 제조공정의 수율을 저해하는 요인으로 작용하게 된다 (Galetto et al., 2015; Pinz et al., 2016; Chen et al., 2017; Gogishvili et al., 2017; Cooper et al., 2018). 이런 T세포 자가살상 효과를 피하기 위해 T세포 대신 NK세포등을 이용한 CAR 치료제를 개발하는 전략이 사용되기도 하지만 (Chen, Wada et al., 2017) T 세포의 독특한 항암 메커니즘과 높은 암살상 효능을 고려할 때, 자가살상 메커니즘에 내성을 갖는 T 세포 개발이 시급한 상황이다.

C. Insufficient anti-tumor activity

혈액암과 달리, 고형암에서는 성공적인 CAR-T 치료제 개발사례가 보고된 바가 없다. 고형암에서 CAR-T 세포의 항암효능은 상당히 제한적인 것으로 알려져 있는데 이는 다음과 같은 면역억제 기전에 기인한다. 첫째, 암세포에 의한 반복적인 T세포 활성화는 전사적/후성유성학적 리프로그래밍을 유도하여 T-cell exhaustion이라 불리는 T세포 불활성화로 이어지게 된다 (Pauken et al., 2016; Schietinger et al., 2016). 둘째, TME에서 T 세포 활성은 PD1, LAG3, DGK (Riese et al., 2013; Nguyen and Ohashi, 2014; Schadendorf et al., 2015)와 같은 다양한 면역억제인자에 의해 저해된다. 기존 면역항암연구들은 저해된 T세포 활성을 회복시키기 위해 PD1 항체나 LAG3항체와 같은 면역관문억제제를 사용해왔으나 (Liu and Wu, 2017) 이런 면역관문억제제는 종종 자가면역반응을 유도하여 임상실험에서 심각한 부작용을 야기하였다 (Naidoo et al., 2015). 또한, 억제성 면역관문 이외에도, 종양에서 발현되는 FAS Ligand (FASL)는 세포살상 T세포의 세포사멸을 촉진하고, T세포를 terminally differentiated T세포로 분화 유도하여 항암효과를 저해할 수 있다 (Peter et al., 2015; Klebanoff et al., 2016). 따라서, 반복적인 T세포 활성화에 따른 exhaustion 및 면역억제 인자에 의해 유도될 수 있는 T세포 억제성 메커니즘을 해결하기 위한 다양한 CAR-T 엔지니어링 전략이 필요한 상황이다 (그림 1).

3. Gene editing strategies for next-generation CAR-T therapies

A. Development of allogeneic CAR-T

안전한 동종유래 CAR-T 치료제를 만들기 위해서는 동종 조혈모이식 임상연구에서 관찰되는 graft versus host diseases (GvHD)를 억제해야 하며, 이를 위해서는 공여자 T세포의 수여자 조직에 대한 면역반응을 차단해야 한다 (Gajewski et al., 2009; Poirot et al., 2015). 이러한 GvH 반응은 공여자 T세포의 TCR과 수여자 HLA에 의해 제시된 외래항원의 상호작용에 의존적이므로 (L Amir et al., 2011), 공여자 T세포의 TCR 복합체를 제거하면 GvH 반응을 효율적으로 억제할 수 있다. 많은 선행 연구들은 TCR과 CD3 isotype으로 이루어진 TCR 복합체 구성요소 중 TCR을 타겟하여 낙아웃 (knockout) 했는데, 이는 allelic exclusion으로 알려진 독특한 유전자 발현조절 메커니즘으로 인해 TCR이 유전자가위에 효율적으로 타겟팅 될 수 있기 때문이다 (Magklara and Lomvardas, 2013). 최근 TCR 낙아웃 CD19 CAR-T를 활용한 임상에서 GvH 없이 높은 항암효과가 관찰되어 TCR 낙아웃 엔지니어링 전략의 임상적 유의성이 검증되었고 (Qasim et al., 2017), 현재까지 다양한 유전자 편집 기술이 TCR 낙아웃을 위해 활용되고 있다. 상가모는 ZFN mRNA를 이용하여 T세포에서 TCR α체인 (TRAC) 또는 TCR β체인(TRBC)을 타겟팅하여 TCR 발현을 T세포에서 제어할 수 있음을 최초로 보고했고 (Provasi et al., 2012), 이후 TALEN이나 CRISPR/Cas9기술을 활용하여 CAR-T세포에서 TRAC을 타게팅한 연구들이 이루어져 왔으며, 이 외에도 TAL의 DNA결합 도메인과 meganuclease가 퓨전된 메가탈(MegaTAL)과, I-CREI homing endonuclease인 ARCUS 같은 다양한 유전자 편집기술들이 TCR 낙아웃에 사용되고 있다 (Osborn et al., 2016; MacLeod et al., 2017; Ren et al., 2017a). 최신 미네소타 대학 연구진이 진행한 TALEN, MegaTAL, CRISPR/Cas9의 온/오프 타겟 효과 비교연구에 따르면, 온타겟 낙아웃 효율측면에서는 MegaTAL과 CRISR/Cas9, 오프타겟 측면에서는 TALEN과 CRISR/Cas9이 T세포에서 우수한 것으로 나타났다 (Osborn, Webber et al., 2016).

효율적인 동종유래 CAR-T를 만들기 위해선 T세포의 체내 지속성을 높여야 하며 이를 위해선 공여자의 T세포가 수여자의 면역시스템을 회피하는 전략이 필요하다. HLA 매개 이식거부(HvG)를 억제하기 위한 방법으로 HLA복합체의 구성요소인 β2-microglobulin (B2M) 유전자가 타겟으로 제안되었으며 (Ren, Liu et al., 2017a), 또 다른 접근법으로 CAR-T 치료 동안 수여자의 면역세포 활성을 억제하기 위한 lymphocyte-depleting agent가 시도되었다. 하지만 lymphocyte-depleting agent는 주입한 CAR-T에도 독성을 띄기 때문에 CAR-T의 항암효과를 저해할 우려가 있어, FDA로부터 승인 받은 다양한 lymphocyte-depleting agent와 병용투여 할 수 있는 CAR-T 치료제를 구축하기 위한 연구가 진행되고 있다. 예를 들어 Cellectis사의 TALEN을 이용한 CD52 낙아웃 CAR-T세포처럼 CAR-T세포가 CD52 항체인 alemtuzumab에 내성을 획득하도록 엔지니어링 하거나 (Poirot, Philip et al., 2015) 유사한 방식으로, clofarabine, fludarabine, cytarabine과 같은 purine nucleotide analogues (PNA) 기반 lymphocyte-depleting agent에 저항성을 띄는 CAR-T를 만들기 위해 deoxycytidine kinase 유전자 (dCK)의 낙아웃이 시도되고 있다 (Valton et al., 2015). 다양한GvH/HvG 회피전략들은 임상시험을 통한 검증이 필요하지만, 유전자편집기술로 안전하며 효과적인 동종유래 CAR-T를 개발하려는 시도는 효율적인 동종유래 CAR-T 제작을 위한 매우 유용한 기술이 될 것으로 전망된다.

B. Broadening the target antigen for hematological malignancies

종양 특이적 표적항원의 제한은 CAR-T세포의 개발을 저해하는 요소 중 하나로, T세포 종양과 다발성 골수종에 대한 CAR-T 개발에서 더욱 문제가 되고 있다. 예를 들어, T세포 종양에서 공통적으로 발현되는 CD4, CD5, CD7 등의 항원은 정상 T세포에서도 발현되는 항원이며, 이 항원들을 타겟팅하는 CAR를 T세포에 발현시키면 CAR-T 세포의 자살을 유도하게 되어 CAR-T의 품질과 생산성을 심각하게 저해할 수 있다. 실례로, CD4 CAR-T, CD5 CAR-T, CD7 CAR-T 생산과정에서 CAR 발현 세포가 지속적으로 감소되는 현상이 보고되었으며 (Pinz, Liu et al., 2016; Fleischer et al., 2017; Cooper, Choi et al., 2018), CAR과 표적 항원의 지속적인 상호작용은 CAR 발현 감소와 T-cell exhaustion을 유도하여 CAR-T의 항종양 효능을 저해하는 것이 관찰되었다 (Fleischer, Raikar et al., 2017; Cooper, Choi et al., 2018). 이러한 문제를 해결하기 위해 CRISPR/Cas9을 통해 T세포에서 CD5 혹은 CD7을 낙아웃하는 엔지니어링이 이루어졌고, 이렇게 낙아웃된 CAR-T는 자살반응 없이 효과적인 항종양 활성을 보여주었다 (Galetto, Chion-Sotinel et al., 2015; Gogishvili, Danhof et al., 2017). 마찬가지로, CS1과 같은 다발성 골수종에 대한 표적항원도 T세포에 편재되어 있기 때문에 전통적인 CAR-T 로 타겟팅하기 어려운 항원이며, Roman Galetto 등은 TALEN을 이용하여 CS1을 비활성화 하였고, 이를 통해 성공적인 CS1 CAR-T 생상공정을 확립할 수 있었다 (Galetto, Chion-Sotinel et al., 2015). 결론적으로 유전자가위 기반 CAR 표적항원의 파쇄는 T세포 자살효과를 방지하여 CAR-T 생산공정을 개선시킬 뿐만 아니라, CAR발현을 유지하고 T-cell exhaustion을 예방하여 T세포의 항종양효과를 증진시키는 효율적인 방법이 될 수 있다.

C. Enhancing efficacy

CAR의 발현양은 항암효과와 비례하므로, 전통적으로 EF1α 또는 LTR과 같은 강력한 프로모터가 CAR 발현에 사용되었다. 그러나, 이러한 강력한 프로모터에 의한 강한 CAR 발현은 T세포 분화 및 T-cell exhaustion을 가속시킬 수 있는 것이 보고되었다 (Eyquem et al., 2017). 메모리얼 슬로언 케터링 암센터 연구진은 CRISPR/Cas9을 활용하여 CAR 유전자를 TRAC 유전자에 삽입했을 때 CAR를 TCR과 유사한 정도로 발현시킬 수 있는 결과를 보였고, 이렇게 구축된 CAR-T세포는 기존의 발현시스템으로 만들어진 CAR-T에 비해 타겟항원과 결합한 이후에도 CAR-T 세포의 기능이 장시간 유지되고 T-cell exhaustion을 성공적으로 회피하는 것으로 관찰되었다.
상기 기술한 CAR knock-in 접근법 외에도, 종양의 면역환경에 의해 유도되는 면역억제를 회피하기 위한 엔지니어링 전략들도 꾸준히 개발되어 왔다. 유전자가위로 PD-1을 불활성화시킨 T세포는 TME에서 effector 기능과 생존이 증가되어 다양한 혈액 및 고형 종양 마우스 모델에서 향상된 항종양 효능을 보여주었다 (Menger et al., 2016; Su et al., 2016; Rupp et al., 2017). 하지만 이런 PD1 낙아웃 엔지니어링에 대해 반대의 결과가 관찰되기도 하는데, 펜실베이니아 대학 (University of Pennsylvania) 연구진은 PD1 낙아웃이 단기관찰에서는 T세포의 세포분열과 세포살상 효과를 향상시키지만, 장기관찰에서는 오히려 T-cell exhaustion을 촉진할 수 있다는 결과를 보고하였다 (Odorizzi et al., 2015). 따라서 PD-1 낙아웃의 정확한 치료적 효능을 평가하기 위해 임상검증과 장기추적 연구가 진행되고 있다. 면역억제를 회피하기 위한 또 다른 낙아웃 타겟은 DGK와 같은 TCR 면역관문이다 (Jung et al., 2017). DGK 낙아웃은 PD-1 불활성화를 통해 CD28의 신호전달을 강화한 이전 연구와는 달리 CD3 신호전달을 증폭시켰고, 이를 통해 TGF-β 및 PGE2 같은 면역억제성 물질에 대해 T 세포의 저항성을 증가시켰다. DGK가 낙아웃된 EGFRvIII CAR-T 세포는 glioblastoma 마우스 모델에서 강화된 종양침윤 및 이펙터 기능을 나타내었고, 고형암에서 높은 임상 적용 가능성을 보였다. 다양한 선행 CAR-T 임상 시험에서 exhausted T세포의 LAG-3 과발현이 관찰되었고 (Eyquem, Mansilla-Soto et al., 2017; Galon et al., 2017) 이에, LAG-3를 낙아웃 할 경우 T 세포의 exhaustion을 막을 수 있을 것으로 기대되었지만 CRISPR/Cas9 기반 LAG-3 낙아웃 CAR-T는 다양한 In vitro, In vivo 실험에서 기능적 향상을 보여주지 못했다 (Zhang et al., 2017). T 세포 생존을 향상 시키기 위한 방법으로는 FAS가 타겟되었으며, FAS 낙아웃 CAR-T는 T세포 활성화에 의해 유도되는 세포사멸에 대해 내성을 보였으며 우수한 세포분열능을 선보였다 (Ren et al., 2017b).

4. Conclusion and Future direction.

2017년 최초의 유전자 조작 세포치료제인 Kymriah와 YESCARTA가 FDA의 승인을 받은 이후 기존 CAR-T 치료제의 안전성 및 유효성을 높이려는 연구가 활발해 진행되고 있으며, CRISPR/Cas9과 같은 정교한 유전자편집기술과 다양한 오프타겟 분석툴의 등장으로 인해 보다 쉽고 정확하게 T세포를 엔지니어링할 수 있는 방법이 가능해짐에 따라 이러한 연구에 더욱 관심이 집중되고 있다. 유전자 편집 기술은 다음과 같은 점에서 기존 CAR-T 치료제가 가진 세가지 의학적 미충족 수요를 해결할 수 있을 것으로 기대된다. 첫째, 유전자 편집을 통한 GvH 및 HvG의 감소는 off-the-shelf CAR-T를 가능케하고, 이에 따라 CAR-T 제조공정의 어려움을 크게 개선시킬 수 있을 것이다. 둘째, CAR-T의 자살현상을 예방함으로써 다양한 암에 대해 CAR 표적항원 선택의 폭을 넓힐 수 있을 것이다. 셋째, 유전자 편집은 반복적인 T세포 활성화와 면역억제성 환경에 의해 유발되는 T세포 기능 저하를 회피할 수 있는 엔지니어링 툴을 제공하여, CAR-T 치료제의 항암효능을 향상시킬 수 있을 것이다. 요약하면 후속 연구를 통해 GvH/HvG, 자살현상, exhaustion과 관련된 다양한 타겟을 발굴하고, 이들에 대해 유전자가위를 사용한 유전자 편집을 시도한다면 항암 효능이 획기적으로 개선된 차세대 CAR-T를 효율적으로 개발할 수 있는 새로운 방법이 될 것으로 기대된다 (그림 1).

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